服務熱線:027-87772229

原創|豬圓環疫苗純化工藝的初探

组六7码了率高吗 www.kdjts.icu 來源:admin  瀏覽量:  發布時間:2017-06-14 09:10:26

摘要:

   


國內絕大部分動物疫苗都是滅活、減毒或無毒的病原體疫苗(第一代動物疫苗),滅活、減毒或無毒的病原體疫苗因為殘留大量的病原體及其碎片、HCP、DNA片段而導致免疫后動物出現不同程度的不良反應,而且疫苗免疫原性和反應原性較低。面對上述動物免疫后出現的不良反應,均采用基因改造、更換表達系統、添加蛋白標簽來提高產量、純度,從側面降低副反應。而這些方式所達到的效果均不顯著,而且這三種方法會涉及到生產工藝的變更和疫苗免疫原性和反應原性不同程度的降低。

豬圓環疫苗現狀

     豬圓環病毒疫苗(porcine circovirus,PCV)有兩個血清型PCV-1和PCV-2,其中PCV-1為非致病性的病毒,PCV-2為致病性的病毒,是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原。

近年來,隨著動物疫苗在疾病預防中的地位日益重要,很多企業把研究力量投入到新的疫苗生產工藝上,對疫苗質量要求也日益提高。豬圓環疫苗評價指標中,除抗原含量外,應激反應是另一重要指標。豬圓環疫苗之所以存在應激反應,是因為現有生產工藝在獲得PCV2抗原的同時,不可避免地伴生了大量異源的與豬圓環病毒免疫無關物質(占比99%以上)。通過分離純化的豬圓環病毒疫苗,不僅可以濃縮提高抗原含量,使抗體效價顯著提升,抗體高峰期提前,還能大幅去除非抗原蛋白,降低應激反應。

豬圓環疫苗的生產方式主要為滅活疫苗和基因工程苗。不同生產方式的疫苗,所需純化的工藝也不同。國內豬圓環疫苗種類、毒株、生產企業名錄詳見表1。

 

              表1:國內豬圓環疫苗種類、毒株、生產企業名錄

疫苗種類

毒株

生產企業

 

豬圓環病毒2型

基因工程苗

CP08

武漢中博、金宇生物

 

 

豬圓環病毒2型

滅活疫苗

SH

江蘇南農高科、普萊柯、吉林正業

LG

哈爾濱維科生物、海利生物

WH

廣東永順、武漢中博、武漢科前、中牧股份、南京天邦

ZJ/C

齊魯動保、浙江諾倍威、瑞普生物、四川華派、浙江薦量

DBN-SX07

大北農、成都天邦、山東華宏

YZ

金宇生物

            資料來源:長江證券研究所研究報告

滅活疫苗的純化工藝

    滅活疫苗多采用微載體懸浮培養的方式來獲得高滴度病毒,滅活疫苗的生產方式得到全病毒顆粒,根據病毒顆粒與雜質分子量的差異,采用4FF或6FF等凝膠過濾介質進行組分分離,病毒顆粒經過層析柱外水體積(層析填料微球之間的孔隙,路徑短)先流出,而蛋白質和核酸經過層析柱內水體積(層析填料微球內部的孔徑,路徑長)后流出,從而達到分離目的。該純化工藝的回收率超過70%,缺點是層析填料用量大,上樣量不能超過層析填料體積的30%,純化效率較低。產品參數詳見表2。


表2:4FF、6FF產品相關參數(凝膠過濾系列)

產品名稱

粒徑(um)

排阻限(球蛋白)

線性流速(cm/h)

操作耐壓(MPa)

高溫高壓(水中)

匯瓊凝4FF

45-165

3×107

300-600

0.3

121℃,20min

匯瓊凝6FF

45-165

4×106

250-600

0.3

121℃,20min 

基因工程苗的純化工藝

PCV-2含有兩個功能性的開放閱讀框(ORF),其中ORF2編碼Cap蛋白是豬圓環病毒的主要結構蛋白,可自我裝配成病毒性粒子,并含有可中和病毒的抗原表位,可誘導機體產生較強的抗體反應并獲得免疫?;?,是設計豬圓環疫苗的首選目標基因。

1、原核表達的純化工藝

在原核表達中,應用較廣的是通過將PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入大腸桿菌原核載體中,利用大腸桿菌進行PCV-2的Cap蛋白與組氨酸(His標簽)融合表達,獲得含His標簽的Cap蛋白,制備亞單位疫苗。

原核表達生產方式得到含有組氨酸(His標簽)的蛋白,根據蛋白質側鏈上的組氨酸(His標簽)對Ni2+等金屬離子有高選擇的特異性,采用Ni-6FF的親和層析介質進行分離純化,由于不同的螯合配基與Ni上的6個原子鍵結合數量不一樣,故Ni-6FF分為3種類型:IDA為3個原子鍵結合配基,3個原子鍵結合蛋白;IMAC為4個原子鍵結合配基,2個原子鍵結合蛋白;TED為5個原子鍵結合配基,1個原子鍵結合蛋白。該純化工藝的回收率和純度是最高的,缺點是原核表達容易出現包涵體,需要加入尿素或鹽酸胍將包涵體進行溶解后純化,然后將純化得到的蛋白進行復性來提高疫苗效果,蛋白復性的難度較大,操作也較為繁瑣。產品參數詳見表3。

 

表3:Ni-6FF產品相關參數(親和層析系列)

產品名稱

結合

能力

粒徑  (um)

蛋白載量

(mg/ml)

線性流速

(cm/h)

特點

匯瓊親Ni-6FF(IDA)

45-165

40-50

300-600

不耐受還原劑及螯合劑

匯瓊親Ni-6FF(IMAC)

45-165

45

300-600

耐受低濃度還原劑和螯合劑

匯瓊親Ni-6FF(TED)

45-165

20-30

150-600

耐受高濃度還原劑、螯合劑及強堿

 

2、真核表達的純化工藝

在真核表達中,應用較廣的是通過將PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入到昆蟲桿狀病毒,用昆蟲細胞培養,獲得重組的PCV-2的Cap蛋白,制備亞單位疫苗,目前昆蟲桿狀病毒表達Cap蛋白制備的基因工程亞單位疫苗已實現商業化應用,故詳述該純化工藝的商業化應用。

真核表達生產方式得到不含標簽的蛋白,根據蛋白的等電點(pI)在不同pH條件下所帶電荷種類不同,采用Q-HPR或SP-HPR通過配基所帶相反電荷進行異性電荷相吸。蛋白緩沖液中pH>pI,蛋白帶負電荷,選用Q-HPR強陰離子交換介質;蛋白緩沖液中pH<pI,蛋白帶正電荷,選用SP-HPR強陽離子交換介質。昆蟲桿狀病毒表達系統使用的培養基等原材料成本非常昂貴,為降低純化工藝中的損失,回收率成為純化工藝要求最主要的指標。產品參數詳見表4。

 

表4:Q-HPR、SP-HPR產品相關參數(離子交換系列)

產品名稱

粒徑

(um)

離子載量(umol/ml)

功能載量

(mg/ml)

線性流速

(cm/h)

操作耐壓

(MPa)

匯瓊離Q-HPR

25-45

180-250(Cl-

120(HSA)

300-400

0.5

匯瓊離SP-HPR

25-45

180-280(H+

100(Lysozyme)

300-400

0.5

應用數據
1、純化圖譜




2、純度檢測


表5:純化前后樣品信息

          檢測指標

純化前后

純度(%)

抗原含量(μg/ml)

外觀

應激反應

顏色

可見雜質

純化前

≤40%

90-100

黃色渾濁

細胞碎片可見

反應劇烈

純化后

≥85%

≥500

透明

較低

純化后回收率:75-85%

發展方向

傳統疫苗的生產工藝中,僅通過離心、過濾和沉淀技術等手段進行簡易的分離,現將離心、過濾、層析等方法的有力結合,逐漸成為動物疫苗分離純化的主流,應用先進的濃縮和分離純化技術是提高疫苗效價、降低應激反應的有效手段,精制疫苗將成為今后發展的必然趨勢。由于本人僅專注于純化工藝的開發,文中錯誤還望各位讀者批評指正,互相學習,共同進步!


。


在線咨詢
助赢手机自动投注软件 中国波兰 36码什么网址 内蒙古时时11选5开奖结果走势图 江西时时中奖不兑 北京pk10赛车稳赚技巧 时时彩玩法 北京pk10一期人工计划 黑龙江时时11 玩pk10有人赢钱吗 七星彩出号规律总结 对刷套利稳赚不赔图片 3d一胆九拖组六 哈尔滨p62开奖结果 三码一肖 鑫宝国娱乐pt游戏平台